Nos services
La plateforme IMPReSs fournit un panel de méthodes et d’outils optimisés pour la production, la purification et l’analyse de protéines recombinantes.
Dans le but de s’adapter au mieux à vos besoins, IMPReSs propose des services modulables allant des étapes de clonage jusqu’à la purification de la protéine d’intérêt et sa caractérisation.
1. Conseil sur les stratégies de production
Nous mettons notre expertise à votre service pour élaborer ensemble les meilleures stratégies de clonage, de production, de purification et d’analyse de la protéine d’intérêt en fonction de vos besoins et de vos contraintes.
2. Clonage
Le clonage du gène d’intérêt peut être pris en charge à partir d’ADN fourni par le client (ADNc ou ADN plasmidique) ou par un prestataire (gène synthétique notamment). La plateforme dispose d’un panel de vecteurs d’expression standards adaptés aux systèmes d’expression utilisés, qui peuvent être personnalisés en fonction de vos besoins (tags d’affinité, séquences de clivage …). Des approches classiques de clonage par restriction / ligation sont habituellement utilisées pour l’obtention des vecteurs recombinants.
3. Tests d’expression
Différents systèmes d’expression sont utilisés en routine au sein de la plateforme pour la production de protéines membranaires (PMs) et cytosolubles, en particulier les systèmes Pichia pastoris et Escherichia coli et diverses lignées cellulaires de mammifères. A travers une étude de faisabilité, la production de la protéine d’intérêt peut ainsi être testée dans le ou les systèmes d’expression disponibles les plus adaptés.
Dans le cas du système d’expression Pichia pastoris, l’utilisation de la technique de Yeastern Blot développée sur la plateforme permet un criblage haut-débit du niveau d’expression de clones recombinants (format plaques 96 puits).
4. Production et préparation des échantillons protéiques
L’étape de production de la protéine d’intérêt peut être réalisée en flasques agitées jusqu’à un volume de 10 litres de milieu, selon vos besoins. Pour des volumes plus importants, des cultures en bioréacteurs de 3 à 20 litres sont également réalisables.
Les PMs peuvent être fournies sous forme de préparations membranaires, obtenues par ultracentrifugation différentielle après lyse cellulaire. Nous proposons également un criblage des conditions d’extraction et de solubilisation des PMs pour un compromis optimal entre rendement d’extraction et qualité des protéines extraites.
5. Purification
La plateforme dispose de cinq chaînes de purification automatisées (de type Äkta Pure, Äkta Purifier et Äkta FPLC), ainsi qu’un panel complet de colonnes et résines de chromatographie d’affinité, d’échange d’ions et d’exclusion de taille. Selon vos besoins, une purification par des méthodes plus spécifiques peut également être mise en place.
Dans le cas de protéines membranaires, un criblage des conditions de purification est fréquemment réalisé afin de s'adapter au mieux aux besoins de chaque protéine et de chaque projet (composition des tampons, criblages de détergents, échanges de détergents, processing des protéines, méthodes chromatographiques...). La reconstitution de PMs en particules lipidiques (nanodisques lipidiques, protéoliposomes…) peut également être réalisée lorsque les conditions le permettent.
6. Caractérisation
A chaque étape, différentes analyses biochimiques sont utilisées pour la caractérisation des échantillons protéiques (électrophorèse, immunodétection, chromatographie d’exclusion de taille…). Des analyses par spectrométrie de masse peuvent également être effectuées en collaboration avec nos collègues du LSMBO (IPHC, Strasbourg).
Lorsqu'ils sont disponibles, des tests d'activités peuvent être réalisés à chaque étape de la production pour une caractérisation avancée des protéines. La plateforme est notamment complètement équipée et accréditée pour réaliser des tests radioactifs tels que fixation de ligands (radiobinding) ou tests de transport, y compris au format 96-puits. Des essais fluorimétriques et des tests d’interaction par SPR sont également envisageables.
7. Collection de PMs recombinantes
La plateforme IMPReSs possède une banque de levures Pichia pastoris exprimant plus d’une centaine de PMs différentes, notamment de la famille des RCPG. Ces protéines peuvent être produites et préparées à différents niveaux de quantités et de qualité pour différentes applications.